ITALIANO

I concetti relativi al flusso dell'informazione genica, già introdotti durante il corso di Biologia e Genetica del primo anno, verranno qui ripresi, approfonditi in chiave molecolare e strutturale ed estesi alle relative implicazioni patogenetiche e farmacologiche.

1: STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI (studio dettagliato)
La struttura chimica degli acidi nucleici. La struttura fisica del DNA. La topologia del DNA e e le DNA topoisomerasi. La struttura dell’RNA.

2: IL MANTENIMENTO DEL GENOMA
La struttura del genoma, la cromatina e il nucleosoma. La replicazione del DNA. Le mutazione e i meccanismi di riparo del DNA.

3: L’ESPRESSIONE DEL GENOMA
La trascrizione dell’RNA. Il processamento dell’RNA. La traduzione

4: LA REGOLAZIONE DEL FLUSSO INFORMAZIONALE
La regolazione della trascrizione nei procarioti. La regolazione della trascrizione negli eucarioti. La regolazione della traduzione I piccoli RNA regolatori

Genomi 4, T.A. Brown Edises
Biologia e Genetica, De Leo et al. Edises
Biologia Molecolare Amaldi et al. Zanichelli

L'insegnamento si pone come obiettivo quello di fornire allo studente le conoscenze dettagliate ed approfondite riguardanti lo studio della struttura, funzione e regolazione delle macromolecole biologiche, quali il DNA, l’RNA e le proteine focalizzando l'attenzione sulle vie biochimiche in cui sono coinvolte. In particolare, verranno affrontati i meccanismi alla base della replicazione e riparazione del DNA e quelli che controllano il flusso dell'informazione genetica dal DNA alle proteine, trascrizione e traduzione, e i relativi meccanismi di regolazione cellulare. In questo modo lo studente sarà in grado di comprendere e conoscere la struttura, la funzione e l'attività delle macromolecole biologiche, e delle vie coinvolte nella regolazione e controllo del flusso dell’informazione biologica.

Non esiste alcuna propedeuticità sebbene è necessario aver acquisito conoscenze di base di chimica generale.

L'insegnamento è organizzato in lezioni frontali con supporto informatico (Power Point) e cartaceo (documenti, lavori scientifici in pdf).

L’esame di verifica si svolgerà mediante prova orale. Le domande riguarderanno gli argomenti inseriti nel programma, spaziando dai meccanismi di biologia cellulare e molecolare alla riproduzione ed ereditarietà dei caratteri. Il voto si esprimerà in trentesimi, da un minimo di 18 ad un massimo di 30. La lode premierà gli studenti particolarmente brillanti nella esposizione e nella capacità di discutere gli argomenti trattati

Si consiglia di contattare il docente per chiarimenti o dubbi relativi agli argomenti trattati. È possibile richiedere un appuntamento inviando una email. I contatti del docente sono disponibili sulla pagina del dipartimento di afferenza
Le slides utilizzante a lezione saranno caricate sulla piattaforma Microsoft Teams nella sezione relativa con la dicitura "File".
L’attività di tutoraggio è disponibile su richiesta.

Modulo 1: Struttura, Topologia e Dinamica degli Acidi Nucleici
1.1 Chimica e Fisiochimica degli Acidi Nucleici
• Basi azotate, nucleosidi e nucleotidi:
o Struttura di purine e pirimidine; forme tautomeriche (cheto-enolica, ammino-imminica) ed effetto sul legame a idrogeno e sulla mutagenesi spontanea.
o Legame N-glicosidico, conformazioni del ribosio e desossiribosio (puckerings del ring: C2'-endo, C3'-endo).
o Nucleotidi ad alta energia (ATP, GTP) e nucleotidi ciclici come secondi messaggeri (cAMP, cGMP).
• Scheletro carbonioso e legame fosfodiesterico:
o Polarità della catena ($5' \rightarrow 3'$) e natura idrofila dello scheletro fosfato.
o Idrolisi alcalina dell'RNA (meccanismo mediante l'ossidrile in 2') e stabilità chimica comparata con il DNA.
1.2 Struttura Fisica e Conformazionale del DNA
• Il modello di Watson-Crick (B-DNA):
o Proprietà geometriche del B-DNA: antiparallelismo, avvolgimento destrogiro, diametro, passo dell'elica, basi per giro.
o Scanalatura maggiore (major groove) e minore (minor groove): riconoscimento molecolare sequenza-specifico da parte delle proteine.
o Forze stabilizzanti: legami a idrogeno inter-base, interazioni di impilamento (stacking elettroni $\pi$) e effetto idrofobico.
• Polimorfismo strutturale del DNA:
o Conformazione A-DNA (condizioni di disidratazione, ibridi DNA-RNA) e Z-DNA (elica sinistrogira, sequenze alternate $GC$, correlazione con l'espressione genica).
• Denaturazione e Rinaturazione (Ibridazione):
o Proprietà spettrofotometriche dell'effetto ipercromico (assorbanza a $260\text{ nm}$).
o Curva di denaturazione termica e determinazione del $T_m$ (temperatura di fusione); fattori influenzanti ($GC\%$, forza ionica, agenti denaturanti).
o Applicazioni biotecnologico-mediche: PCR, Microarray, Southern Blot, e tecniche di Next Generation Sequencing (NGS).
1.3 Topologia del DNA e DNA Topoisomerasi
• Geometria e topologia della doppia elica circolare e vincolata:
o Parametri topologici: Linking Number ($Lk$), Twist ($Tw$), e Writhe ($Wr$). L'equazione fondamentale $Lk = Tw + Wr$.
o Superavvolgimento (supercoiling) positivo e negativo: significato fisiologico nel compattamento e nell'accessibilità del genoma.
• Le DNA Topoisomerasi:
o Topoisomerasi di Tipo I: Meccanismo a sbalzo (swivel), taglio a singolo filamento, assenza di ATP.
o Topoisomerasi di Tipo II: Meccanismo a porta (gate process), taglio a doppio filamento, dipendenza da ATP (es. Topoisomerasi II $\alpha$ e $\beta$).
o Farmacologia clinica ed Inibitori delle Topoisomerasi:
 Inibitori batterici (DNA girasi): Fluorochinoloni (Ciprofloxacina, Levofloxacina) come antibatterici.
 Inibitori eucariotici (Antitumorali): Camptotecine (Irinotecan, Topotecan per topo I), Epipodofillotossine (Etoposide per topo II), Antracicline (Doxorubicina).
1.4 Struttura, Conformazione e Varietà dell'RNA
• Caratteristiche strutturali dell'RNA:
o Presenza di uracile e 2'-OH; capacità di formare strutture secondarie e terziarie complesse (strutture a stelo-loop, hairpin, pseudonodi).
o Attività catalitica dell'RNA: I Ribozimi (meccanismo d'azione, autosplicing, peptidil-trasferasi ribosomiale).
• Classi funzionali di RNA:
o RNA codificanti: mRNA.
o RNA non codificanti strutturali e di servizio: rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA.
o RNA regolatori: miRNA, siRNA, lncRNA, circRNA.
Modulo 2: Il Mantenimento del Genoma e la Stabilità Genomica
2.1 Architettura Genomica, Cromatina e Nucleosoma
• Organizzazione del genoma eucariotico e umano:
o Frazione codificante vs. non codificante; sequenze ripetute (retrotrasposoni, LINE, SINE, DNA satellite, microsatelliti/STR).
o Applicazioni medico-legali e cliniche delle STR (DNA fingerprinting).
• Il Nucleosoma e l'organizzazione della cromatina:
o L'ottamero istonico ($H2A, H2B, H3, H4$) e l'istone linker $H1$.
o Avvolgimento del DNA ($147\text{ pb}$) attorno all'ottamero.
o Livelli di compattamento: dalla fibra a "filo di perle" ($10\text{ nm}$) alla fibra da $30\text{ nm}$, anse cromosomiche e struttura del cromosoma mitotico.
o Eterocromatina (costitutiva e facoltativa) ed Eucromatina: Marcatori e significato funzionale.
• Rimodellamento e modifica epigenetica della cromatina:
o Modificazioni post-traduzionali delle code istoniche (Coda $N$-terminale): Acetilazione (HAT vs HDAC), Metilazione (HMT vs HDM), Fosforilazione, Ubiquitinazione.
o Il codice istonico (Histone Code) e reclutamento di fattori proteici (bromodomini e cromodomini).
o Epigenetica e patologia umana: Inattivazione del cromosoma X (gene XIST), imprinting genomico (Sindrome di Prader-Willi / Angelman).
2.2 La Replicazione del DNA
• Meccanismo generale della replicazione:
o Modello semiconservativo (Esperimento di Meselson-Stahl); bidirezionalità e forchetta di replicazione.
• Inizio della replicazione:
o Origini di replicazione nei procarioti ($oriC$) e negli eucarioti (sequenze ARS, complesso ORC).
o Reclutamento delle elicasi ($DnaB$ nei procarioti, complesso $MCM2-7$ negli eucarioti), proteine di legame al singolo filamento (SSB / RPA), e la DNA Primasi.
• Allungamento della catena nucleotidica:
o Direzionalità $5' \rightarrow 3'$ e sintesi asimmetrica: filamento guida (leading) e filamento ritardato (lagging). I frammenti di Okazaki.
o L'enzimologia avanzata della replicazione eucariotica: DNA Polimerasi $\alpha$ (primasi/inizio), $\delta$(sintesi lagging), $\epsilon$ (sintesi leading), e $\gamma$ (replicazione mitocondriale).
o Il morsetto scorrevole (sliding clamp - PCNA) e il caricatore del morsetto (clamp loader - RFC).
o Processamento dei frammenti di Okazaki (Fen1/RNasi H) e saldatura da parte della DNA Ligasi (meccanismo AMP-dipendente).
• Fidelity della replicazione:
o Selezione del nucleotide, attività di correzione delle bozze (proofreading esonucleasico $3' \rightarrow 5'$).
• Il problema della replicazione terminale e i Telomeri:
o Struttura dei telomeri (ripetizioni $TTAGGG$) e cappuccio proteico (Shelterina).
o La Telomerasi: ribonucleoproteina e trascrittasi inversa endogena.
o Ruolo dei telomeri nell'invecchiamento cellulare (limite di Hayflick) e nella trasformazione neoplastica.
2.3 Mutazioni e Meccanismi di Riparo del DNA
• Eziologia e tipologia delle mutazioni:
o Mutazioni puntiformi (transizioni, transversioni; silenti, missenso, nonsenso, frameshift).
o Danneggiamenti esogeni ed endogeni: deaminazione spuria (C $\rightarrow$ U, 5-meC $\rightarrow$ T), depurinazione, lesioni ossidative ($8-oxo-G$), agenti alchilanti.
o Danni strutturali da radiazioni: dimeri di pirimidina indotti da UV; rotture a singolo filamento (SSB) e a doppio filamento (DSB) indotte da radiazioni ionizzanti.
• Sistemi cellulari di Riparo del DNA:
o Riparo per Escisione di Basi (BER): DNA glicosilasi, sito AP, AP endonucleasi, polimerasi/ligasi.
o Riparo per Escisione di Nucleotidi (NER):
 Via Global Genome (GG-NER) e Transcription-Coupled (TC-NER).
 Reclutamento di endonucleasi ($XPF, XPG$), TFIIH (funzione elicasi).
 Correlazione clinica: Xeroderma Pigmentosum, Sindrome di Cockayne.
o Riparo dei Mismatch (MMR):
 Riconoscimento del filamento neosintetizzato, complessi MutS/MutL (nell'uomo MSH2, MSH6, MLH1, PMS2).
 Correlazione clinica: Cancro Colorettale Ereditario Non Poliposico (HNPCC / Sindrome di Lynch).
o Riparo delle rotture del doppio filamento (DSB):
 Non-Homologous End Joining (NHEJ): Ku70/Ku80, DNA-PKcs, propensione all'errore.
 Ricombinazione Omologa (HR): Complessi MRN, BRCA1, BRCA2, RAD51. Risoluzione della giunzione di Holliday.
 Correlazione clinica: Mutazioni germinali di BRCA1/BRCA2 e suscettibilità al tumore della mammella/ovaio; approccio terapeutico con inibitori di PARP (lethal synthetycity).
Modulo 3: L’Espressione del Genoma: Trascrizione e Traduzione
3.1 La Trascrizione dell'RNA
• L'Unità di Trascrizione e l'RNA Polimerasi:
o Struttura e funzione dell'RNA Polimerasi procariotica (Holoenzima e fattore $\sigma$).
o Le RNA Polimerasi eucariotiche: Pol I (rRNA), Pol II (mRNA, snRNA, miRNA), Pol III (tRNA, 5S rRNA).
• Architettura dei Promotori Eucariotici (Pol II):
o Elementi del promotore core: TATA box, INR, DPE.
o Complessi di Inizio Generali (GTF): TFIID (TBP), TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH (attività chinasica e idrolasica/elicasi per la fusione del DNA).
o Formazione del Complesso di Inizio Aperto (PIC) e Transizione all'allungamento tramite fosforilazione del dominio $C$-terminale (CTD) della Pol II (serina 5 e serina 2).
• Allungamento e Terminazione:
o Processività dell'RNA polimerasi e fattori di allungamento.
o Terminazione procariotica (Rho-dipendente e Rho-indipendente/intrinseca).
o Terminazione eucariotica accoppiata con il segnale di poliadenilazione.
3.2 Il Processamento e la Maturazione dell'RNA
• Modificazioni all'$1'$-estremità ed al $3'$-estremità dell'mRNA:
o Capping al $5'$: Aggiunta della 7-metilguanosina (legame $5'-5'$ trifosfato); ruolo nella stabilità, export nucleare e inizio della traduzione.
o Poliadenilazione al $3'$: Complessi CPSF/CstF, taglio e aggiunta della coda di Poli(A) ad opera della Poli(A) Polimerasi (PAP); protezione dalla degradazione da esonucleasi.
• Lo Splicing dell'mRNA (Pre-mRNA Splicing):
o Anatomia del trascritto: siti di splicing al $5'$ (GU) e al $3'$ (AG), punto di ramificazione (Branch Site A), tratto polipirimidinico.
o Il Spliceosoma: assemblaggio dinamico delle snRNP (U1, U2, U4, U5, U6).
o Meccanismo chimico: Due reazioni sequenziali di transesterificazione e formazione della struttura a cappio (lariat).
o Splicing Alternativo: Meccanismi regolatori (esoni cassetta, siti $5'/3'$ alternativi, ritenzione intronica). Aumento della diversità proteomica.
o Elementi in cis (Splicing Enhancers/Silencers: ESE, ESS) e fattori in trans (Proteine SR, hnRNP).
o Implicazioni patologiche: Mutazioni nei siti di splicing (Thalassemia $\beta$, Atrofia Muscolare Spinale - SMA) e farmaci a oligonucleotidi antisenso (ASO, es. Nusinersen).
3.3 La Traduzione del Codice Genetico
• Il Codice Genetico:
o Proprietà: decifrazione, ridondanza/degenerazione, non sovrapposizione, assenza di punteggiatura, universalità e sue eccezioni (mitocondri).
o Ipotesi dell'oscillazione (Wobble Hypothesis) di Crick e ruolo dell'Inosina.
• I componenti della macchinario traduzionale:
o tRNA: Struttura a trifoglio (secondaria) e a "L" (terziaria).
o Amminoacil-tRNA Sintetasi: La "seconda decifrazione del codice genetico"; meccanismo di caricamento dell'amminoacido (AMP-intermedio) e attività di proofreading.
o Il Ribosoma: Struttura delle subunità nei procarioti ($70S = 50S + 30S$) ed eucarioti ($80S = 60S + 40S$). I tre siti operativi: A (Amminoacidico), P (Peptidilico), E (Exit).
• Le Fasi della Traduzione:
o Inizio:
 Inizio Cap-dipendente negli eucarioti: Fattori di inizio (eIF4E, eIF4G, eIF4A - complesso eIF4F), selezione del tRNA iniziatore ($Met-tRNA_i^{Met}$), complesso di pre-inizio $43S$, e scansione fino al codone AUG (sequenza di Kozak).
 Inizio IRES-dipendente (Internal Ribosome Entry Site): meccanismo cap-indipendente in stress cellulare o infezioni virali.
o Allungamento:
 Reclutamento dell'amminoacil-tRNA (eEF1A/EF-Tu), formazione del legame peptidico (attività catalitica della peptidil-trasferasi ribosomiale dell'rRNA 28S/23S), traslocazione ribosomiale (eEF2/EF-G).
o Terminazione e Riciclo:
 Riconoscimento dei codoni di stop (UAA, UAG, UGA) mediante i fattori di rilascio (eRF1, eRF3); idrolisi del peptidil-tRNA e disassemblaggio del complesso.
• Farmacologia Clinica - Inibitori della sintesi proteica (Antibiotici):
o Aminoglicosidi (Streptomicina), Tetracicline, Clorfenicolo, Macrolidi (Eritromicina), Puromicina. Differenze di selettività tra $70S$ e $80S$.
Modulo 4: La Regolazione del Flusso Informazionale e l'Epigenetica
4.1 La Regolazione della Trascrizione nei Procarioti
• Concetto di Operone:
o Regolazione coordinata in risposta a segnali metabolici/ambientali.
• L'Operone Lattosio (Lac Operon):
o Controllo negativo tramite il repressore $LacI$ (induzione da allolattosio).
o Controllo positivo da catabolita: la proteina CAP/CRP e la percezione dei livelli di glucosio/cAMP.
• L'Operone Triptofano (Trp Operon):
o Repressione genica e meccanismo di Attenuazione della trascrizione basato sul ripiegamento dell'mRNA guida e l'accoppiamento trascrizione-traduzione.
4.2 La Regolazione della Trascrizione negli Eucarioti
• Architettura degli elementi regolatori in cis:
o Promotori prossimali, Enhancers (intensificatori), Silencers (silenziatori) e Insulators (elementi isolanti che delimitano i domini cromatinici TADs).
• Fattori di Trascrizione Specifici (TFs):
o Moduli di legame al DNA: Dominio Helix-Turn-Helix, Zinc Finger (Dita di Zinco), Leucine Zipper (Cerniera di Leucina), Helix-Loop-Helix (bHLH).
o Domini di attivazione e ripiegamento del DNA; Interazioni con il complesso Mediatore e con i macchinari di rimodellamento della cromatina (SWI/SNF).
• Silenziamento Genico e Metilazione del DNA:
o Le DNA Metiltrasferasi (DNMT1 per il mantenimento; DNMT3a/DNMT3b de novo).
o Isole CpG, metilazione dei promotori e blocco trascrizionale diretto o indiretto (proteine MeCP2).
o Correlazioni patologiche: Rett Syndrome (mutazioni in MECP2), ipermetilazione di oncosoppressori nei tumori (es. BRCA1, p16INK4a).
4.3 Regolazione Post-Trascrizionale e Post-Traduzionale
• Controlli a livello dell'mRNA:
o Stabilità ed emivita degli mRNA: sequenze AU-rich ($AREs$) nei regioni $3'-UTR$ e proteine stabilizzanti/destabilizzanti.
o Sorveglianza dell'mRNA: degradazione guidata da errori (Nonsense-Mediated mRNA Decay - NMD).
• Controllo della Traduzione:
o Fosforilazione di eIF2 $\alpha$ in condizioni di stress cellulare (risposta integrata allo stress).
o Controllo mediato da proteine di legame all'RNA: Esempio della regolazione dell'Omeostasi del Ferro (Proteine IRP1/IRP2 ed elementi IRE su mRNA di Ferritina e Recettore del Transferrina).
4.4 Piccoli RNA Regolatori e Silenziamento Genico (RNA Interference)
• I microRNA (miRNA):
o Biogenesi: Trascrizione dei pri-miRNA da parte della Pol II, processamento nucleare ad opera del complesso Drosha/DGCR8.
o Export nucleare (Esportina-5) e taglio citoplasmatico da parte di Dicer per generare il duplex di miRNA ($\sim 22\text{ nt}$).
o Caricamento nel complesso RISC (proteine Argonaute / AGO2).
o Meccanismi d'azione nel mondo animale: Appaiamento imperfetto con il $3'-UTR$ del target, inibizione della traduzione e/o degradazione dell'mRNA.
o Ruolo patogenetico ed oncologico: OncomiR e Oncosoppressori-miR; sviluppo di marcatori circolanti nel sangue (biomarcatori circolanti).
• Gli Small Interfering RNA (siRNA):
o Origine esogena/endogena, appaiamento perfetto con l'mRNA target e taglio endonucleolitico guidato da Ago2.
• Applicazioni Terapeutiche dell'RNAi e degli RNA Sintetici:
o Piattaforme terapeutiche basate su siRNA (es. Patisiran, Inclisiran per l'ipercolesterolemia).
o Vaccini a mRNA (struttura, modifica con pseudouridina, incapsulamento in nanoparticelle lipidiche - LNP).

Italian

The concepts related to the flow of genetic information, previously introduced during the first-year Biology and Genetics course, will be revisited here, explored in greater depth from a molecular and structural perspective, and extended to their pathogenetic and pharmacological implications.

1: STRUCTURE OF NUCLEIC ACIDS (in depth analysis)
The chemical structure of nucleic acids. The physical structure of DNA. The DNA topology. The structure of RNA.

2: MAINTENANCE OF GENOMA
The structure of the genome, the chromatin and the nucleosome. DNA replication. Mutations and DNA repair mechanisms.

3: THE EXPRESSION OF GENOME
RNA transcription. RNA processing. Translation

4: THE ADJUSTMENT OF THE INFORMATION FLOW
The regulation of transcription in prokaryotes. Regulation of transcription in eukaryotes.

Genomi 4, T.A. Brown Edises
Biologia e Genetica, De Leo et al. Edises
Biologia Molecolare Amaldi et al. Zanichelli

The course aims to provide students with the in depth and detailed knowledge concerning the study of the structure, function and regulation of biological macromolecules, such as DNA, RNA and proteins, focusing attention on the biochemical pathways in which they are involved. In particular, the mechanisms underlying DNA replication and repair will be addressed, as well as those that control the flow of genetic information from DNA to proteins, transcription and translation, and the related mechanisms of cell regulation. In this way the student will be able to understand the structure, function and activity of biological macromolecules, and of the routes involved in the regulation and control of the flow of biological information.

There are no prerequisites for this course; however, it is necessary to have acquired basic knowledge of general chemistry.

The course is organized in lectures with computer support (Power Point) and paper (documents, scientific works in pdf).

The assessment will take place through an oral exam. The questions will cover topics included in the program, ranging from cellular and molecular biology mechanisms to reproduction and the inheritance of traits. The grade will be expressed out of thirty, with a minimum of 18 and a maximum of 30. Honors will be awarded to students who are particularly outstanding in their presentation and ability to discuss the topics covered

It is recommended to contact the professor for any clarifications or questions regarding the topics covered. An appointment can be requested by sending an email. The professor's contact information is available on the department's webpage.
The slides used during the lectures will be uploaded to the Microsoft Teams platform in the "Files" section.
Tutoring is available upon request.

Detailed Syllabus: Molecular Biology
Degree Course: Medicine and Surgery (2nd Year)
Target Level: Undergraduate / Medical Student
Module 1: Structure, Topology, and Dynamics of Nucleic Acids
1.1 Chemistry and Physicochemistry of Nucleic Acids
• Nitrogenous bases, nucleosides, and nucleotides:
o Structure of purines and pyrimidines; tautomeric forms (keto-enol, amino-imino) and their effect on hydrogen bonding and spontaneous mutagenesis.
o $N$-glycosidic bond, ribose and deoxyribose conformations (ring puckerings: C2'-endo, C3'-endo).
o High-energy nucleotides (ATP, GTP) and cyclic nucleotides as second messengers (cAMP, cGMP).
• Backbone structure and phosphodiester bond:
o Strand polarity ($5' \rightarrow 3'$) and the hydrophilic nature of the phosphate backbone.
o Alkaline hydrolysis of RNA (2'-hydroxyl-mediated mechanism) and comparative chemical stability with DNA.
1.2 Physical and Conformational Structure of DNA
• The Watson-Crick model (B-DNA):
o Geometric properties of B-DNA: antiparallel orientation, right-handed helix, diameter, helical pitch, base pairs per turn.
o Major and minor grooves: sequence-specific molecular recognition by proteins.
o Stabilizing forces: inter-base hydrogen bonding, base stacking ($\pi$-electron interactions), and hydrophobic effect.
• Structural polymorphism of DNA:
o A-DNA conformation (dehydrated conditions, DNA-RNA hybrids) and Z-DNA (left-handed helix, alternating $GC$ sequences, correlation with gene expression).
• Denaturation and Renaturation (Hybridization):
o Spectrophotometric properties of the hyperchromic effect (absorbance at $260\text{ nm}$).
o Thermal denaturation curve and determination of $T_m$ (melting temperature); influencing factors ($GC\%$, ionic strength, denaturing agents).
o Biotechnological and medical applications: PCR, Microarrays, Southern Blot, and Next-Generation Sequencing (NGS) techniques.
1.3 DNA Topology and DNA Topoisomerases
• Geometry and topology of circular and constrained DNA:
o Topological parameters: Linking Number ($Lk$), Twist ($Tw$), and Writhe ($Wr$). The fundamental equation: $Lk = Tw + Wr$.
o Positive and negative supercoiling: physiological significance in genome packaging and accessibility.
• DNA Topoisomerases:
o Type I Topoisomerases: Swivel mechanism, single-strand break, ATP-independent.
o Type II Topoisomerases: Gate mechanism, double-strand break, ATP-dependent (e.g., Topoisomerase II $\alpha$ and $\beta$).
o Clinical Pharmacology and Topoisomerase Inhibitors:
 Bacterial inhibitors (DNA gyrase): Fluoroquinolones (Ciprofloxacin, Levofloxacin) as antibacterial agents.
 Eukaryotic inhibitors (Antineoplastics): Camptothecins (Irinotecan, Topotecan for Topo I), Epipodophyllotoxins (Etoposide for Topo II), Anthracyclines (Doxorubicin).
1.4 Structure, Conformation, and Diversity of RNA
• Structural characteristics of RNA:
o Presence of uracil and 2'-OH; ability to form complex secondary and tertiary structures (stem-loops, hairpins, pseudoknot structures).
o Catalytic activity of RNA: Ribozymes (mechanism of action, self-splicing, ribosomal peptidyl transferase).
• Functional classes of RNA:
o Coding RNA: mRNA.
o Structural and housekeeping non-coding RNAs: rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA.
o Regulatory RNAs: miRNA, siRNA, lncRNA, circRNA.
Module 2: Genome Maintenance and Genomic Stability
2.1 Genomic Architecture, Chromatin, and the Nucleosome
• Organization of the eukaryotic and human genome:
o Coding vs. non-coding regions; repetitive sequences (retrotransposons, LINEs, SINEs, satellite DNA, microsatellites/STRs).
o Forensic and clinical applications of STRs (DNA fingerprinting).
• The Nucleosome and chromatin organization:
o The histone octamer ($H2A, H2B, H3, H4$) and the linker histone $H1$.
o DNA wrapping ($147\text{ bp}$) around the octamer core.
o Levels of compaction: from the "beads-on-a-string" fiber ($10\text{ nm}$) to the $30\text{ nm}$ fiber, chromosomal loops, and mitotic chromosome structure.
o Heterochromatin (constitutive vs. facultative) and Euchromatin: Molecular markers and functional significance.
• Chromatin remodeling and epigenetic modifications:
o Post-translational modifications of histone tails ($N$-terminal tail): Acetylation (HATs vs. HDACs), Methylation (HMTs vs. HDMs), Phosphorylation, Ubiquitination.
o The Histone Code and recruitment of protein modules (bromodomains and chromodomains).
o Epigenetics in human disease: X-chromosome inactivation (XIST gene), genomic imprinting (Prader-Willi / Angelman Syndrome).
2.2 DNA Replication
• General mechanism of replication:
o Semiconservative model (Meselson-Stahl experiment); bidirectionality and replication forks.
• Initiation of replication:
o Origins of replication in prokaryotes ($oriC$) and eukaryotes (ARS sequences, ORC complex).
o Recruitment of helicases ($DnaB$ in prokaryotes, $MCM2-7$ complex in eukaryotes), single-stranded DNA-binding proteins (SSB / RPA), and DNA Primase.
• Polynucleotide chain elongation:
o $5' \rightarrow 3'$ directionality and asymmetric synthesis: leading strand and lagging strand. Okazaki fragments.
o Advanced enzymology of eukaryotic replication: DNA Polymerases $\alpha$ (primase/initiation), $\delta$(lagging strand synthesis), $\epsilon$ (leading strand synthesis), and $\gamma$ (mitochondrial DNA replication).
o The sliding clamp (PCNA) and clamp loader (RFC).
o Processing of Okazaki fragments (Fen1/RNase H) and sealing by DNA Ligase (AMP-dependent mechanism).
• Replication fidelity:
o Nucleotide selection, exonucleolytic $3' \rightarrow 5'$ proofreading activity.
• The end-replication problem and Telomeres:
o Telomere structure ($TTAGGG$ repeats) and the Shelterin protective complex.
o Telomerase: Endogenous ribonucleoprotein reverse transcriptase.
o Role of telomeres in cellular senescence (Hayflick limit) and neoplastic transformation.
2.3 Mutations and DNA Repair Mechanisms
• Etiology and classification of mutations:
o Point mutations (transitions, transversions; silent, missense, nonsense, frameshift mutations).
o Exogenous and endogenous DNA damage: spontaneous deamination (C $\rightarrow$ U, 5-meC $\rightarrow$T), depurination, oxidative lesions ($8-oxo-G$), alkylating agents.
o Radiation-induced structural damage: UV-induced pyrimidine dimers; single-strand breaks (SSBs) and double-strand breaks (DSBs) induced by ionizing radiation.
• Cellular DNA Repair Systems:
o Base Excision Repair (BER): DNA glycosylases, AP site generation, AP endonuclease, DNA polymerase/ligase.
o Nucleotide Excision Repair (NER):
 Global Genome (GG-NER) and Transcription-Coupled (TC-NER) pathways.
 Recruitment of endonucleases ($XPF, XPG$), TFIIH complex (helicase activity).
 Clinical correlation: Xeroderma Pigmentosum, Cockayne Syndrome.
o Mismatch Repair (MMR):
 Recognition of the newly synthesized strand, MutS/MutL complexes (human homologs MSH2, MSH6, MLH1, PMS2).
 Clinical correlation: Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (HNPCC / Lynch Syndrome).
o Double-Strand Break (DSB) Repair:
 Non-Homologous End Joining (NHEJ): Ku70/Ku80, DNA-PKcs, error-prone nature.
 Homologous Recombination (HR): MRN complex, BRCA1, BRCA2, RAD51. Resolution of the Holliday junction.
 Clinical correlation: Germline mutations in BRCA1/BRCA2 and susceptibility to hereditary breast/ovarian cancer; targeted therapy with PARP inhibitors (synthetic lethality).
Module 3: Expression of the Genome: Transcription and Translation
3.1 RNA Transcription
• The Transcription Unit and RNA Polymerase:
o Structure and function of prokaryotic RNA Polymerase (Holoenzyme and $\sigma$ factor).
o Eukaryotic RNA Polymerases: Pol I (rRNA), Pol II (mRNA, snRNA, miRNA), Pol III (tRNA, 5S rRNA).
• Architecture of Eukaryotic Promoters (Pol II):
o Core promoter elements: TATA box, INR, DPE.
o General Transcription Factors (GTFs): TFIID (TBP), TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH (kinase activity and ATP-dependent helicase for DNA melting).
o Formation of the Pre-Initiation Complex (PIC) and promoter escape via phosphorylation of the $C$-terminal domain (CTD) of Pol II (Serine 5 and Serine 2).
• Elongation and Termination:
o Processivity of RNA polymerase and elongation factors.
o Prokaryotic termination (Rho-dependent and Rho-independent/intrinsic).
o Eukaryotic termination coupled with the polyadenylation signal.
3.2 RNA Processing and Maturation
• Modifications at the $5'$ and $3'$ ends of mRNA:
o $5'$ Capping: Addition of 7-methylguanosine ($5'-5'$ triphosphate linkage); role in stability, nuclear export, and translation initiation.
o $3'$ Polyadenylation: CPSF/CstF complexes, cleavage, and addition of the Poly(A) tail by Poly(A) Polymerase (PAP); protection against exonucleolytic degradation.
• Pre-mRNA Splicing:
o Transcript anatomy: $5'$ splice site (GU), $3'$ splice site (AG), branch point site (Branch Site A), polypyrimidine tract.
o The Spliceosome: dynamic assembly of snRNPs (U1, U2, U4, U5, U6).
o Chemical mechanism: Two sequential transesterification reactions and formation of the lariat structure.
o Alternative Splicing: Regulatory mechanisms (exon skipping, alternative $5'/3'$ sites, intron retention). Expansion of proteomic diversity.
o Cis-regulatory elements (Splicing Enhancers/Silencers: ESE, ESS) and trans-acting factors (SR proteins, hnRNPs).
o Pathological implications: Mutations in splice sites ($\beta$-Thalassemia, Spinal Muscular Atrophy - SMA) and antisense oligonucleotide (ASO) therapeutics (e.g., Nusinersen).
3.3 Translation of the Genetic Code
• The Genetic Code:
o Properties: deciphering, redundancy/degeneracy, non-overlapping nature, lack of punctuation, universality, and mitochondrial exceptions.
o Crick's Wobble Hypothesis and the structural role of Inosine.
• Components of the Translational Machinery:
o tRNA: Cloverleaf (secondary) and L-shaped (tertiary) structures.
o Aminoacyl-tRNA Synthetases: The "second genetic code"; amino acid charging mechanism (AMP-intermediate) and proofreading activity.
o The Ribosome: Subunit architecture in prokaryotes ($70S = 50S + 30S$) and eukaryotes ($80S = 60S + 40S$). Functional sites: A (Aminoacyl), P (Peptidyl), E (Exit).
• Phases of Translation:
o Initiation:
 Cap-dependent initiation in eukaryotes: Initiation factors (eIF4E, eIF4G, eIF4A forming the eIF4F complex), initiator tRNA recruitment ($Met-tRNA_i^{Met}$), $43S$ pre-initiation complex, scanning mechanism to the AUG start codon (Kozak consensus sequence).
 Cap-independent initiation via IRES (Internal Ribosome Entry Sites): mechanism during cellular stress or viral infection.
o Elongation:
 Aminoacyl-tRNA delivery (eEF1A/EF-Tu), peptide bond formation (ribosomal peptidyl transferase activity of 28S/23S rRNA), ribosomal translocation (eEF2/EF-G).
o Termination and Ribosome Recycling:
 Stop codon recognition (UAA, UAG, UGA) by Release Factors (eRF1, eRF3); cleavage of the peptidyl-tRNA bond and disassembly of the complex.
• Clinical Pharmacology - Protein Synthesis Inhibitors (Antibiotics):
o Aminoglycosides (Streptomycin), Tetracyclines, Chloramphenicol, Macrolides (Erythromycin), Puromycin. Selective toxicity between $70S$ and $80S$ ribosomes.
Module 4: Regulation of Information Flow and Epigenetics
4.1 Transcriptional Regulation in Prokaryotes
• The Operon Concept:
o Coordinated gene regulation in response to metabolic and environmental cues.
• The Lactose Operon (Lac Operon):
o Negative regulation via the $LacI$ repressor (allolactose induction).
o Positive catabolite regulation: CAP/CRP protein and sensing of glucose/cAMP levels.
• The Tryptophan Operon (Trp Operon):
o Repression and Transcriptional Attenuation driven by leader mRNA folding and transcription-translation coupling.
4.2 Transcriptional Regulation in Eukaryotes
• Architecture of Cis-Regulatory Elements:
o Proximal promoters, Enhancers, Silencers, and Insulators (demarcating Topologically Associating Domains - TADs).
• Specific Transcription Factors (TFs):
o DNA-binding domains: Helix-Turn-Helix, Zinc Finger, Leucine Zipper, Basic Helix-Loop-Helix (bHLH).
o Activation domains and DNA bending; interactions with the Mediator complex and ATP-dependent chromatin remodelers (SWI/SNF).
• Gene Silencing and DNA Methylation:
o DNA Methyltransferases (DNMT1 for maintenance; DNMT3a/DNMT3b for de novo methylation).
o CpG islands, promoter hypermethylation, and direct or indirect transcriptional silencing (MeCP2 proteins).
o Clinical pathology: Rett Syndrome (mutations in MECP2), tumor suppressor hypermethylation in cancer (e.g., BRCA1, p16INK4a).
4.3 Post-Transcriptional and Post-Translational Regulation
• Control at the mRNA Level:
o mRNA stability and half-life: AU-rich elements ($AREs$) in $3'-UTRs$ and stabilizing/destabilizing RNA-binding proteins.
o mRNA surveillance pathways: Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD).
• Translational Control:
o Phosphorylation of eIF2$\alpha$ under cellular stress conditions (Integrated Stress Response).
o RNA-binding protein-mediated regulation: Iron homeostasis model (IRP1/IRP2 proteins and Iron Responsive Elements - IREs on Ferritin and Transferrin Receptor mRNAs).
4.4 Small Regulatory RNAs and Gene Silencing (RNA Interference)
• MicroRNAs (miRNA):
o Biogenesis: Transcription of pri-miRNAs by Pol II, nuclear processing by the Drosha/DGCR8 microprocessor complex.
o Nuclear export (Exportin-5) and cytoplasmic cleavage by Dicer to generate miRNA duplexes ($\sim 22\text{ nt}$).
o Loading into the RNA-Induced Silencing Complex (RISC) featuring Argonaute proteins (AGO2).
o Mechanism of action in animals: Imperfect base pairing with $3'-UTRs$, translational repression, and mRNA destabilization.
o Pathological role in oncology: OncomiRs and tumor suppressor miRNAs; circulating miRNAs as liquid biopsy biomarkers.
• Small Interfering RNAs (siRNA):
o Exogenous/endogenous origin, perfect complementary pairing with target mRNA, and Ago2-mediated endonucleolytic cleavage.
• Therapeutic Applications of RNAi and Synthetic RNA:
o siRNA-based therapeutic platforms (e.g., Patisiran, Inclisiran for hypercholesterolemia).
o mRNA vaccines (structural optimization, pseudouridine modifications, Lipid Nanoparticle - LNP encapsulation).